УДК 578.74; 578.85; 543.45
Болтовец П.Н.1, Снопок Б.А.2,
Шевченко Т.П.3, Дяченко Н.С.1,
Роуэлл Ф.4, Ширшов Ю.М2

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПОВЕРХНОСТНОГО ПЛАЗМОННОГО
РЕЗОНАНСА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСОВ И МАЛЫХ МОЛЕКУЛ

1Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины
Украина, Киев, ул. Заболотного 154
т.266-99-41, mailto: pboltovec@mail.ru
2Институт физики полупроводников НАН Украины
Украина, Киев, Проспект Науки 45
3Национальный Университет им.Тараса Шевченко
Украина, Киев, ул. Владимирская, 2
4 Centre for Pharmaceutical and Environmental Analysis,
School of Science, University of Sunderland (UK)

Одним из перспективных путей разработки методов экспресс-диагностики
различных заболеваний, обусловленых различными агентами (от вирусов до
низкомолекулярных токсинов) представляется использование оптоэлектронных
преобразователей, в частности, основанных на эффекте поверхностного плазмонного
резонанса, ППР (surface plasmon resonance, SPR), состоящем в изменении угла
минимальной интенсивности отраженного плоскополяризованного света в результате
процессов адсорбции-десорбции молекул на поверхности металлической пленки [1].
Основные преимущества использования подобного рода систем перед
традиционными методами исследования обусловлены возможностью экспрессного
получения информации, непосредственного исследования межмолекулярных
взаимодействий и анализа кинетических параметров процесса связывания, что
позволяет определить механизм такого процесса, а также отсутствием необходимости
в дорогих меченых реактивах.
Простота и экспрессность методик, основанных на использовании
оптоэлектронных преобразователей, позволяют разрабатывать удобные в
практическом использовании процедуры для оперативной диагностики вирусных
инфекций в клинических условиях, а также для определения содержания
потенциальных патогенов в окружающей среде. Однако, несмотря на достаточно
широкое примененияе метода ППР для изучения различных белков, даный метод не
нашел еще широкого распространения для выявления вирусов и малых молекул,
поскольку его применение в классическом вари анте невозможно для их
непосредственной детекции.
Как модельный объект для отработки системы детекции вирусов использовался
вирус с хорошо известной пространственной структурой и небольшими размерами,

каким является вирус табачной мозаики. Исследования проводились с помощью
ППР-спектрометра "ПЛАЗМОН" (источник возбуждения GaAs лазер,
=670 нм), разработанном в Институте физики полупроводников НАН
Украины [2].
1,6
Иммобилизация
комплекса

да
нн
ы е ППР


2,0
1,4
данные ИФА
специфических антивирусных





1,2
иммуноглобулинов (IgG) с
1,5
1,0
ППР





вирусом
на
поверхности
,
0,8
от





1,0
н
сенсора, модифицированной
OD
.
0,6
ед
.





тиоцианатом и белком А
0,4
0,5
Staphylococcus aureus,





0,2
ориентирующим
0,0
0,0
0
7
14
21
28
35
имуноглобулины
на
дни

поверхности
сенсора,
Рис.1. Сравнение результатов выявления
позволяет
обеспечить
вируса в гомогенатах листьев Nicotiana
количественное
выявление
tabacum, взятого на разных стадиях
вируса. Это обусловлено тем,
инфекции, полученных методами ППР и
что изменение резонансного
ИФА: OD - оптическая плотность.
угла QSPR зависит не только

от толщины слоя молекул на
поверхности, но и от плотности образуемых на поверхности структур, которая,
в свою очередь, зависит от количественного соотношения между компонентами
комплекса. В случае преобладания в смеси молекул антигена на поверхности
образуются болем плотные структуры и наблюдается более высокий уровень
сигнала. В противоположном случае формируются структуры с меньшей
плотностью и уровень сигнал при этом ниже.
При
определении
вируса
в
180
гомогенатах листьев Nicotiana





160
tabacum, взятых на разных стадиях
140





инфекции путем иммобилизации
120
комплекса специфических IgG с





100
.s.
80
вируссодержащим
материалом
, a r





sp
60
Q
было
получено
согласование





40
между данными, полученными
20





методами ППР и ИФА (Рис.1).
0
-20
1E-3
0,01
0,1
1
10
В случае исследования малых
CF concentration, mkg/ml
молекул
непосредственная

регистрация
взаимодействия
Рис.2. Определение концентрации
между
аналитом
и сефтазидима в растворе сендвич-
специфическими
методом.
иммуноглобулинами
методом

ППР не представляется возможной вследствие малого изменения
коэффициента преломления при формировании поверхностного слоя.
Однако опосредованное выявление таких взаимодействий возможно. Так,
например, если молекулы аналита несут на своей поверхности несколько
эпитопов, их выявление ваозможно с помощью сендвич-метода, при
использовании
которого
молекулы,
провзаимодействовавшие
с
иммобилизированными на поверхности антителами, выявляються
благодаря последующему взаимодейстсвию с иммуноглобулинами,
находящимися в растворе. В работе такой поход использовался для
определения концентрации антибиотика цефтазидима (CF) в растворе
(Рис.2).
Кроме того, концентрация малых молекул в растворе опосредовано
может
быть
определена
500





конкурентным методом. В
450
этом случае на поверхности





сенсора
иммобилизируется
400





аналит,
с
которым
.s. 350
, a





специфические
spr
Q 300
иммуноглобулины





взаимодействуют
после
250





преинкубации с аналитом в
200
растворе. При этом уровень
1E-3
0,01
0,1
1
10
сигнала
обратно
smx concentration, mkg/ml
пропорционален

концентрации
аналита
в
Рис.3.
Определение
концентрации
растворе. Результаты анализа
сульфаметаксазола в растворе методом
содержания
антибиотика
конкурентного анализа.
сульфаметаксазола (smx) с
использованием такого подхода представлены на рис.3.
Таким образом в работе рассмотрены возможности метода
поверхностного плазмонного резонанса для исследования вирусов и малых
молекул.

1. Homola J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors
// Anal Bioanal Chem. -2003. - 377. - P.528-539.
2. Rengevych O.V., Shirshov Yu.M., Ushenin Yu.V., Beketov G.V.
Separate determination of thikness and optical parameters by surface
plasmon resonance: accurancy consideration // Semiconductor Physics,
Quantum Electronics & Optoelectronics. - 1999. - 2. - P. 28-35

Работа выполнена при поддержке INTAS00-00870, INTAS-2001-2382.